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低背景化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒說明書

cECL Western Blot Kit

目錄號：K0048

保存條件：2-8℃避光保存。

本產(chǎn)品僅供科研使用，請勿用于臨床診斷及其他用途產(chǎn)品簡介

　　低背景化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒是免疫印跡實驗中與辣根過氧化物酶（HRP）配套使用

的的低背景底物檢測試劑盒。本產(chǎn)品能夠在HRP的催化下發(fā)生化學(xué)反應(yīng)而發(fā)光，可用于

檢測固定在膜上的蛋白質(zhì)等生物大分子。其高靈敏度能夠檢測ng級別的抗原，發(fā)光信號

強烈持久，可以使用照相技術(shù)（X-光膠片曝光）或者其他成像方法（如熒光或化學(xué)發(fā)光

成像儀）進行檢測。

注意事項

1. 為獲得zui佳實驗結(jié)果，請務(wù)必優(yōu)化實驗條件，包括檢測樣品的用量、一抗、二抗稀

釋度、雜交膜及封閉試劑的選擇，抗體孵育及膜洗滌步驟中請使用搖床輔助完成。

2. 由于奶粉中含有內(nèi)源性生物素，在使用親和素/生物素系統(tǒng)時，封閉液中應(yīng)避免使用   奶粉。

3. 免疫印跡實驗進行全過程中，使用充足的洗滌緩沖液、封閉液、抗體稀釋液和底物

反應(yīng)液以*覆蓋印跡，確保印跡膜始終處于濕潤狀態(tài)，避免干燥。使用大量的封

閉液和洗滌液，可以降低非特異信號。

4. 由于疊氮鈉是HRP抑制劑，在緩沖液中應(yīng)避免使用疊氮鈉作為防腐劑。

5. 在與膜發(fā)生接觸過程中，請佩戴手套且使用干凈鑷子等潔凈器材，避免蛋白污染及

高背景。

6. 避光條件下，配制好的化學(xué)發(fā)光檢測底物工作液可在室溫下穩(wěn)定保存8小時。陽光

或其他強光會影響工作液，故應(yīng)避免強光長時間的照射。正常實驗室燈光短時間照射不影響工作液的使用。

7. 上海研謹(jǐn)提供多種蛋白轉(zhuǎn)移用膜、封閉液、一抗、酶標(biāo)二抗、緩沖液等，詳情請查

   詢目錄或網(wǎng)站。

操作步驟

注意：務(wù)必使用推薦的抗體稀釋濃度以獲得陽性結(jié)果，zui佳抗原和抗體用量須通過預(yù)

實驗來確定。

1．二抗孵育完畢后，將印跡膜充分洗滌。

2．根據(jù)需要量，將增強型發(fā)光劑和穩(wěn)定劑按照1：1的比例等體積混合，配制為化學(xué)發(fā)

光檢測底物工作液（例如：一張8 cm×6 cm的膜使用1 ml工作液）。

3．棄去洗滌緩沖液，將發(fā)光底物工作液滴加在印跡膜上，確保工作液覆蓋整張膜，室

溫孵育3-5分鐘。

4．用移液器吸去多余發(fā)光底物工作液，將印跡膜置于兩層干凈的塑料薄膜之間，此過

程應(yīng)小心完成，避免膜與膜之間產(chǎn)生氣泡。

5．在暗室內(nèi)進行X-光膠片曝光，或?qū)⒛し胖玫綗晒?、化學(xué)發(fā)光成像儀內(nèi)，按照儀器說

明書進行檢測。

   注意：一抗推薦用量為50 ng/ml-1 μg/ml，二抗推薦用量為5 ng/ml-50 ng/ml。

相關(guān)實驗材料

K0043  TBST(TBS with Tween-20，pH8.0)          K0058  NC膜(0.45μm)

K0052  蛋白示蹤上樣緩沖液（還原）            K2002  NC膜(0.22μm)

K0053  蛋白示蹤上樣緩沖液（非還原）           K0059  PVDF膜(0.45μm)

K0054  WB封閉液I（BSA）                 K2003  PVDF膜(0.22μm)

K0055  WB封閉液II（奶粉）                K0060  X線暗盒

K0056  蛋白印跡膜再生液                 K0061  X光膠片

K0057  麗春紅染色液                   K0062  定影粉

K0044  Tris Glycine轉(zhuǎn)膜緩沖液              K0063  顯影粉

常見問題解答

問題                        

1.膠片反相（白色條帶，黑色背景）

2.膜上出現(xiàn)棕色或黃色條帶

3.暗室中看到強烈發(fā)光

4.發(fā)光信號持續(xù)時間過短

可能原因： 系統(tǒng)中HRP過量                     

解決方法：稀釋HRP標(biāo)記物至少10倍以上

問題：信號較弱或者無信號

可能原因：

a發(fā)光反應(yīng)系統(tǒng)中HRP過多，消耗稀釋底物過快，引起信號迅速降低

b抗原/抗體量不夠

c蛋白轉(zhuǎn)移率低

解決方法：

a稀釋HRP 標(biāo)記物至少10倍以上

b增加抗原/抗體使用量

c優(yōu)化轉(zhuǎn)移系統(tǒng)

問題：高背景

可能原因：

a系統(tǒng)中HRP過量

b 封閉不足

c 封閉試劑選擇不當(dāng)

d 沖洗不充分

e曝光過度

f抗原/抗體濃度過高   

解決方法：

a稀釋HRP標(biāo)記物至少10倍以上

b優(yōu)化封閉程序

c選擇另一種封閉試劑

d增加沖洗時間，次數(shù)

e減少曝光時間

f降低抗原/抗體使用濃度

問題：蛋白條帶為點狀

可能原因：

a蛋白轉(zhuǎn)移失敗

b膜未平衡                       

c膠片與膜之間有氣泡                               

解決方法：

a優(yōu)化轉(zhuǎn)移過程

b按照說明書處理膜

C曝光前去除所有氣泡

問題：出現(xiàn)非特異條帶 （高背景、信號維持時間較短）

可能原因：系統(tǒng)中HRP過多   

解決方法：稀釋HRP標(biāo)記物

問題： 出現(xiàn)非特異條帶（背景干凈信號維持時間正常）

可能原因：

1. 一抗用量過多                                  

2. SDS導(dǎo)致非特異結(jié)合

解決方法：

1.進一步稀釋一抗

2. 在實驗過程中避免使用SDS

      使用本產(chǎn)品的文獻

      Lu X, Zhang N, Meng B, et al. Involvement of GPR12 in the regulation of cell proliferation and survival. Mol Cell

      Biochem. 2012 Mar 20

      He J, Kang L, Wu T, et al. An elaborate regulation of mTOR activity is required for somatic cell reprogramming

      induced by defined transcription factors. Stem Cells Dev. 2012 Apr 3

      Lu X, Zhang N, Dong S, et al. Involvement of GPR12 in the induction of neurite outgrowth in PC12 cells. Brain

      Res Bull. 2012 Jan 4;87(1):30-6.

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