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產(chǎn)品目錄
pBM16A Toposmart Cloning Kit常見問題分析
更新時間:2021-03-10 點擊量:2458

pBM16A Toposmart Cloning Kit

 

 

產(chǎn)品信息:

 

組 成

YCL071-01

YCL071-02

pBM16A Vector (20ng/ml )

20ml

20ml×3

10×Toposmart

20ml

20ml×3

Control Insert

5ml

5ml

M13F Primer

0.1OD

0.1OD×3

M13R Primer

0.1OD

0.1OD×3

保存條件:-20℃保存,有效期一年。

產(chǎn)品介紹:

pBM16A Toposmart克隆試劑盒利用痘苗病毒的拓撲異構(gòu)酶I(Topoisomerase I)的切割再連接的特點將片段克隆到載體中。不僅適用于克隆由PfuKOD、XeroxPhusion Q5等高保真DNA聚合酶擴增的平末端PCR產(chǎn)物,也可克隆由TaqTthklenTaqDNA聚合酶擴增的帶A尾的PCR產(chǎn)物。試劑盒中的pBM16A載體為線性化的質(zhì)粒。可以用引物對M13FM13R進行菌落PCR鑒定陽性克隆。

產(chǎn)品特點:

1連接反應(yīng)僅需5 分鐘。

2適用于平末端PCR產(chǎn)物和帶A尾的PCR產(chǎn)物。

3載體采用了新的制備工藝,無需藍白斑篩選。

  1. 克隆位點兩旁都有Smal和EcoR V酶切位點,適合單酶切鑒定。
  2. 載體具有氨芐青霉素抗性。

操作步驟:

1. 連接反應(yīng)

按下表,在一個0.2ml PCR 管中依次加入加完試劑后,輕輕混勻低速離心,使溶液集中在管底。

成分

體積

DNA -*片段

0.5-8µl

pBM16A Topo載體

1ml

10×Toposmart

1ml

補水至總體積

10ml

 注意:此步驟不要在低溫條件下(冰水浴)上操作。

 2. 反應(yīng)溫度及片段要求

室溫下20-30℃)放置 0-5 分鐘,然后將離心管放置在冰上。如當天不進行轉(zhuǎn)化實驗。請將連接產(chǎn)物置于-20℃保存。

注意:DNA-*片段的用量見下表

 

片段大?。?/span>bp

建議用量(ng

100-1000

20-50

1000-2000

50-100

2000-5000

100-200

 

室溫下20-30℃)反應(yīng)時間 5-30 分鐘,如果室溫較低,推薦使用 PCR 儀器控制溫度。可以設(shè)置 25℃反應(yīng) 5 分鐘。如果 PCR 產(chǎn)物電泳檢測僅有很銳利明亮的條帶,無引物二聚體和非特異性條帶存在,可直接取 0.5-1µl PCR 產(chǎn)物原液進行克隆。

3. 陽性對照反應(yīng)

1µl 試劑盒提供的1kb長度的對照片段LacZ 基因α肽片段進行克隆,轉(zhuǎn)化具有α 互補功能的大腸桿菌感受態(tài)細胞( DH5α,*0,Mach1-T1 。菌液涂布在含有IPTG,X-gal LB 氨芐平板上,次日藍色菌落為陽性克隆,說明有片段插入,白色菌落為空載體。

4. 轉(zhuǎn)化

1.5µl 連接產(chǎn)物到50-100µl 剛剛?cè)诨母惺軕B(tài)細胞中,輕輕混勻,冰浴2-30 分鐘。

2.42℃水浴中熱擊30 秒鐘。

3. 立刻置于冰水浴中2 分鐘。

加入300-500µl 無菌的不含抗生素的SOC LB,37℃,200-250rpm 振蕩培養(yǎng)60 鐘。

注:小于 2kb 片段可以不復蘇,直接涂平板。

  • 吸取200µl 菌液涂布。為了得到更多的菌落,可以先4000rpm 離心1 分鐘,去掉部分上清,用移液器輕吹菌體,充分懸浮菌液,取全部菌液涂布,然后 37℃培養(yǎng)過夜12-16 小時。

5. 陽性重組子的鑒定菌落 PCR

(1) 菌落PCR方法鑒定陽性克隆

① 用10ml吸頭挑選克隆至預(yù)先加有10μl無菌水或LB培養(yǎng)基的PCR管中,吹打混合。

25ml PCR反應(yīng)體系:取2μl細菌懸液為模板、加入5μM 濃度的M13F/M13R

1μl進行PCR擴增。

PCR擴增條件:95℃預(yù)變性5分鐘(裂解細胞,失活核酸酶),94℃變性10鐘,55℃退火10秒鐘,72℃延伸 根據(jù)片段的大小決定延伸時間,通常每1min/1kbX秒,30個循環(huán),72℃后延伸5分鐘。1%瓊脂糖凝膠電泳分析擴增結(jié)果,有強烈的明顯條帶的克隆為重組體,與插入片段大小相近M13F/M13R 引物在克隆位置的兩側(cè),所以PCR擴增出的DNA的長度比插入片段大138bp 可視為陽性克隆。菌落PCR方法鑒定重組子時一定要設(shè)立一個不加菌液的陰性對照。

(2) 測序:用M13F、M13R通用引物對陽性質(zhì)粒進行測序分析。

pBM16A載體圖譜

 

 
 
常見問題分析

 

重組子克隆菌少,或陽性率低:

(1) 感受態(tài)效率低,使用轉(zhuǎn)化效率>5×107cfu/µg 的感受態(tài)細胞

(2) 連接反應(yīng)在低溫下(如放碎冰上)操作,應(yīng)該在室溫下操作。

(3) PCR 片段加入量太多或太少,按照推薦量加入。

(4) PCR 純度低,重新擴增或重新純化PCR 產(chǎn)物。

(5) PCR 質(zhì)量低,切膠時在紫外下照射時間長,需重新制備。

(6) PCR 擴增結(jié)束后,應(yīng)該再延伸5-10 分鐘,確保片段延伸*。

(7) 轉(zhuǎn)化后沒有復蘇培養(yǎng),可以加入SOC LB,培養(yǎng)60分鐘。

  • 克隆基因可能對宿主菌有毒性,比如某些編碼膜蛋白和 DNA 結(jié)合蛋白的基因,某些啟動子和調(diào)節(jié)序列基因,或含有倒置或串聯(lián)重復序列的基因,選用室溫過夜培養(yǎng)平板。

 

載體序列:

>pBM16A Topo AGTGAGTTGATTGTGTAAAACGACGGCCAGTGTCTGAGGCTCGCTTCAGTCCTGATGCTTGATATCCCGGGCGT GTCGCCCTT$$$$AAGGGCGACACGCCCGGGATATCGCGTCTGCCTGAAGTCAATACTGACGATGGTCATAGCT GTTTCCTGTCCATAGCAGAAAGTCAAAAGCCTCCGACCGGAGGCTTTTGACTTGATCGGCACGTAAGAGGTTCC AACTTTCACCATAATGAAATAAGATCACTACCGGGCGTATTTTTTGAGTTATCGAGATTTTCAGGAGCTAAGGA AGCTAAAATGAGTATTCAACATTTCCGTGTCGCACTTATTCCGTTTTTTGCGGCATTTTGCCTTCCTGTTTTTG CTCACCCAGAAACGCTGGTGAAAGTAAAAGATGCTGAAGATCAGTTGGGTGCACGAGTGGGTTACATCGAACTG GATCTCAACAGCGGTAAGATCCTTGAGAGTTTTCGCCCCGAAGAACGTTTTCCAATGATGAGCACTTTTAAAGT TCTGCTATGTGGCGCGGTATTATCCCGTATTGACGCCGGGCAAGAGCAACTCGGTCGCCGCATACACTATTCTC AGAATGACTTGGTTGAGTACTCACCAGTCACAGAAAAGCATCTTACGGATGGCATGACAGTAAGAGAATTATGC AGTGCTGCCATAACCATGAGTGATAACACTGCGGCCAACTTACTTCTGACAACGATCGGAGGACCGAAGGAGCT AACCGCTTTTTTGCACAACATGGGGGATCATGTAACTCGCCTTGATCGTTGGGAACCGGAGCTGAATGAAGCCA TACCAAACGACGAGCGTGACACCACGATGCCTGTAGCAATGGCAACAACGTTGCGCAAACTATTAACTGGCGAA CTACTTACTCTAGCTTCCCGGCAACAATTAATAGACTGGATGGAGGCGGATAAAGTTGCAGGACCACTTCTGCG CTCGGCCCTTCCGGCTGGCTGGTTTATTGCTGATAAATCTGGAGCCGGTGAGCGTGGCTCTCGCGGTATCATTG CAGCACTGGGGCCAGATGGTAAGCCCTCCCGTATCGTAGTTATCTACACGACGGGGAGTCAGGCAACTATGGAT GAACGAAATAGACAGATCGCTGAGATAGGTGCCTCACTGATTAAGCATTGGTAATGAGGGCCCAAATGTAATCA CCTGGCTCACCTTCGGGTGGGCCTTTCTGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATC ACAAAAATCGATGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGA AGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAG CGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTG TGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGA CACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGA GTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGAACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAG TTACCTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTT GCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATTTTCTACCGAAGAAAGGCCCAC CCGTGAAGGTGAGCC

                                                           本產(chǎn)品僅供研究不用于臨床診斷

實驗代做服務(wù):

ELISA試劑盒免費代檢測

CCK8檢測

HE染色

蛋白相互作用分析

Western Blot

免疫組化IHC染色

熒光定量PCR

動物模型服務(wù)

流式細胞檢測

免疫熒光染色

激光共聚焦

DNA甲基化實驗

石蠟/冰凍切片

透射電鏡服務(wù)

掃描電鏡實驗

蛋白雙向(2-D)

動物實驗

免疫共沉淀

原位雜交(FIsh

蛋白質(zhì)純化

分子克隆和質(zhì)粒載體構(gòu)建服務(wù)

組蛋白甲基化磷酸化乙?;?/a>

 

蛋白雙向2D-WB

 

藥理毒理動物實驗

 

番紅O固綠染色

明膠酶譜MMP

酶活性檢測

動物造模/模型實驗服務(wù)

                                    

 

滬公網(wǎng)安備 31011802001677號

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